REPLI-g单细胞试剂盒

从单个细胞或有限的样品材料中进行高度均匀的全基因组扩增（WGA）

• 单细胞材料的WGA具有完整的基因组覆盖范围
• 由于MDA技术，基因组基因座的无偏扩增
• 经过优化，可与包括NGS在内的新技术配合使用
• 一致的产量高达40 µg（平均产物长度> 10 kb）
• 用于癌症研究，干细胞研究或宏基因组学的新型工具

使用创新仪器（例如下一代测序（NGS）平台）进行生物样品的DNA序列分析和基因分型通常受限于少量样品。REPLI-g单细胞试剂盒专门设计用于从单细胞（1至<1000个细菌或肿瘤细胞）或纯化的基因组DNA中均匀扩增基因组DNA，并具有完整的基因组覆盖范围。其他协议也可用于新鲜或干燥血液或新鲜或冷冻组织。的缓冲液和试剂经过*的受控去污程序，以避免扩增污染性DNA，从而确保每次都获得高度可靠的结果。创新的多重置换扩增（MDA）技术可实现具有可忽略的序列偏倚且无基因组缺失的基因组准确扩增。

REPLI-g单细胞试剂盒

REPLI-g单细胞试剂盒适用于分子生物学应用。本产品不用于诊断，预防或治疗疾病。

产品详情

性能

完整的基因组覆盖范围，非常适合NGS和其他下游应用

使用REPLI-g单细胞试剂盒扩增的DNA的平均产物长度> 10 kb，并具有大的基因组覆盖范围。它已通过众多下游分析进行了测试，并非常适用于这些分析，包括下一代测序（NGS），阵列比较基因组杂交（aCGH）和基于实时PCR的应用（请参见表2）。由于不需要单独的基于PCR的扩增步骤，因此与基于PCR的方法相比，REPLI-g全基因组扩增和文库制备所需的动手时间更少，读取长度更长（请参见“使用与基于PCR的方法相比，REPLI-g扩增的DNA需要更少的动手时间并产生更多的序列信息“）。高质量的，可比的NGS结果表明，纯化的基因组DNA或REPLI-g单细胞扩增的DNA均可实现高百分比的序列覆盖率和非常低的错误率，包括仅从单个细菌细胞开始的情况（见图） “可比NGS结果”）。这些发现是通过宽范围的标记覆盖所有人类常染色体和X染色体的全面分析强调，具有3个不同的独立的实验表明DNA被成功地从基因组的所有区域扩增无单次辍学（见图“完整的基因组覆盖范围”）。

REPLI-g单细胞试剂盒优于其他供应商的试剂盒

其他供应商通常使用的基于PCR的WGA方法导致短片段被PCR引物序列终止，这可能会影响下游过程（例如，下一代测序；请参见图“使用REPLI-g扩增的DNA进行的下一代测序需要更少的动手时间，比基于PCR的方法产生更多的序列信息”）。基于PCR的WGA可能导致容易出错的扩增，例如，导致单个碱基对突变，STR收缩和扩增，并且由于使用低保真酶Taq而导致基因座的偏倚和代表性不足DNA聚合酶。相比之下，REPLI-g单细胞试剂盒可在整个基因组中提供高度均匀的扩增，且扩增过程中基因座偏向小。使用每种试剂盒*的单细胞扩增方案，测试了四种WGA试剂盒（包括REPLI-g单细胞试剂盒）和2种利用MDA技术的2种基于PCR的方法的序列表示和基因座缺失。与REPLI-g单细胞试剂盒不同，使用其他供应商的试剂盒分析的单细胞通常无法完整无偏地显示序列（请参见“从单细胞无偏DNA扩增”图）。

原理

REPLI-g单细胞试剂盒包括REPLI-g sc聚合酶，这是创新的高保真酶Phi 29聚合酶的优化配方，可使用多重置换扩增（MDA）技术扩增复杂的基因组DNA，并进行温和的碱性孵育以确保非常低的DNA/片段化或无碱基位点的产生。它经过专门设计，可从单个细胞（例如分离的肿瘤细胞或细菌）提供高产量的扩增DNA（请参见表1）。此外，它还可以用于各种临床和非临床研究样品以及纯化的基因组DNA，同时还可以使用其他方案来处理新鲜或干燥的血液以及新鲜或冷冻的组织。无论模板的起始量如何，典型的DNA产量始终可达到40 µg，这意味着随后的遗传分析无需进一步测量DNA浓度即可进行。平均产物长度超过10 kb，并且具有完整的基因组覆盖范围，确保使用REPLI-g单细胞试剂盒扩增的DNA非常适合众多下游应用，包括下一代测序（NGS），基于阵列的比较基因组杂交（阵列CGH） ），焦磷酸测序和实时PCR分析（表2）。

放大原理

REPLI-g单细胞试剂盒使用等温基因组扩增，称为多重置换扩增（MDA），涉及随机六聚体与变性DNA的结合，然后在恒定温度下用优化形式的Phi 29聚合酶进行链置换合成，它具有异常强的股线位移特性。在每条置换的链上都可充当模板，从而引发额外的引发事件，从而可产生高产量的扩增DNA（见图“多重置换扩增（MDA）技术”）。Phi 29聚合酶是一种噬菌体衍生的酶，是一种具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校对活性）的DNA聚合酶，其保真度比Taq高1000倍DNA聚合酶。在*，优化的REPLI-g单细胞缓冲液系统的支持下，Phi 29聚合酶可以轻松解决二级结构（如发夹环），从而防止扩增过程中聚合酶的滑动，终止和解离。这样就可以产生高达100 kb的DNA/片段，而不会产生序列偏倚（请参见“用Phi 29聚合酶进行无偏扩增”）。

DNA的细胞裂解和碱变性

在用于酶促扩增程序之前，必须先对基因组DNA进行变性，这通常使用苛刻的方法完成，例如在高温下孵育（热孵育）或在pH值升高（化学碱性孵育）的情况下。REPLI-g单细胞试剂盒使用温和的碱性孵育，可实现gDNA的细胞裂解和均匀的DNA变性，而DNA/片段化程度极低或无碱基位点的产生。这导致扩增的DNA具有非常高的完整性，并大化了扩增片段的长度，因此基因组位点和序列被均匀地表示（参见“热和碱变性对位点表示的影响”图）。

有效消除可检测的DNA污染

所有REPLI-g单细胞试剂盒组件均经过*的受控去污程序，以确保消除所有REPLI-g可扩增的污染DNA。通过创新和标准化的程序将缓冲液和试剂暴露在紫外线辐射下，以确保不存在任何可检测到的残留污染性DNA（请参见“创新性去污程序”图）。经过紫外线处理后，套件会进行严格的质量控制，以确保完整的功能。

程序

简单的一管程序

REPLI-g单细胞试剂盒使用简单可靠的方法从单细胞或有限样品中获得准确的基因组扩增。简单的反应设置和非常短的处理时间（约15分钟）使这成为一种简单而可靠的方法（请参见“ REPLI-g单细胞试剂盒程序”图）。已开发出的缓冲液和试剂，可从单个细胞，有限的组织材料和纯化的DNA中获得高产量的DNA，并具有完整的序列表示和无偏扩增（表3）。REPLI-g扩增的DNA可以在–20°C下长期保存，不会产生负面影响（请参见“一致的长期稳定性”图）。